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ELISA实验常见现象及原因总结
ELISA实验因灵敏度高，特异性强在生物科研上得到了广泛的认可，但对初学者而言，如不注意实验操作过程中的各个环节，可能会对最终的实验结果产生较大影响，如实验出现白板、显色弱灵敏度低、背景OD值高等现象。下面对以上实验现象原因进行解析。
1. “白板”现象
在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中所有孔的颜色均为无色，即无信号呈现。出现该现象的可能原因：
① 相关试剂已超过有效期，不同批次稀释液交叉使用；
② 错加漏加相关试剂如HRP酶络合物等；
③ 酶标记物的活性和效价比较低或者酶标记物被污染失活，溶液中含有酶抑制剂如叠氮化钠等；
④ 配制相关试剂的蒸馏水可能被污染；
⑤ 洗涤液是浓缩型的，未按照相关比例进行稀释；
⑥ 溶液的pH值过低或者过高，一般溶液的pH值应保持在7.2-7.4。
2. 显色弱灵敏度低
在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中孔的显色比较浅，即只有微弱的信号呈现。出现该现象的可能原因：
① 试剂盒已经超过有效期，试剂盒未按规定进行保存；
② 试剂盒在使用前未平衡至室温；
③ 试剂加液体积或试剂稀释的比例不正确；
④ 洗板或者加样过程中，酶标物受污染失活；
⑤ 孵育时间和孵育温度未达到实验要求；
⑥ 洗涤过程中出现问题如洗涤液稀释倍数不符合要求，洗板次数过多，洗板冲击力过大以及洗板浸泡时间过长；
⑦ 底物溶液TMB显色时间太短。
3. 背景OD值高
在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中的孔有颜色但是0孔OD值较高即背景OD值较高。出现该现象的可能原因：
① 底物溶液TMB未按照要求条件保存而导致自身显色；
② 孵育温度过高或者孵育时间过长，发生了较强的非特异性吸附；
③ 未按说明书要求洗板，洗涤液体积、洗涤次数以及洗涤时间不足；拍板未拍干净；
④ 加样时未更换移液器枪头造成交叉污染；
⑤ 在操作过程中孔内混用HRP酶（HRP酶浓度太高）；
⑥ 酶标仪设定参数不合适（双波长读数时不需要设置“空白调零”）。
4. 标准曲线良好，样本检测值过低的原因
客户操作没有问题，标准曲线良好，但检测多次样本依然不在试剂盒检测范围。即标准曲线良好，样本检测值过低。出现该现象的可能原因有：
① 样本原因：存储（存储时间和存储温度）不当以及反复冻融；
② 稀释方案不正确：稀释过度导致样本OD值低于试剂盒检测限；稀释倍数不足，存在“钩状效应”导致样本OD值偏低；
③ 待测指标本身原因：目的指标本身在健康生物体内含量极低，导致样本OD值低于试剂盒检测限；
④ 试剂盒未按要求保存（保存温度和保存时间)。
5. 整板“全阳”
在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中所有孔的颜色均为蓝色，即整板“全阳”。出现该现象的可能原因：
① 样本原因：放置时间过长导致污染；样本处理不当，含非特异性显色或干扰显色的内源性成分(如脂质、胆红素、血红蛋白等)；组织匀浆或细胞提取液中引入其他试剂导致基质效应过高等；
② 孵育时间，孵育温度未按照说明书要求操作；
③ HRP酶浓度偏高：HRP酶络合物稀释比例不足；洗涤不充分导致HRP酶残留；重复使用移液器枪头导致污染；
④ 底物TMB污染或者受到强光以及强紫外线的照射；
⑤ 蒸馏水受到污染；
⑥ “竞争法”原理试剂盒按照“夹心法”原理试剂盒步骤操作；
以上为ELISA实验中对应实验现象以及产生原因。
综上所述，在进行ELISA实验时，只有对实验细节进行把控，才能得到准确的实验结果。
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