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发布时间：2023-06-15
文章来源：瑞迪生物
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一、WB结果中背景较高
1. 如果出现均一性高背景，可能从抗体、实验操作和缓冲液三方面寻找原因：
（1）抗体相关
一抗、二抗浓度较高，应选择最适宜的抗体稀释度，优化稀释条件；或者一抗孵育的温度偏高，建议4℃过夜孵育。
抗体储存时间较长或储存条件不佳导致抗体失活：宜选择新的抗体。
（2）实验操作相关
检测时曝光时间过长，可减少曝光时间；
膜封闭不够，宜优化封闭的时间和温度、选择合适的封闭液；
膜的选择有问题：实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜；
孵育中洗膜不充分：适当增加洗膜时间和次数；确保在充分震荡的条件下孵育膜，并且抗体充分覆盖膜表面。
（3）缓冲液相关
缓冲液中去污剂不足，应增加TBST中Tween 20的浓度；
转膜液、封闭液等不新鲜或被污染，宜现配现用。
2. 若出现的是斑点或闪烁式的非均一性高背景，除以上原因之外，还可能存在以下问题：
（1）抗体相关
二抗聚集：使用前过滤二抗或更换二抗；
封闭剂中有聚集体：使用前过滤封闭剂或者更换。
（2）缓冲液相关
仪器污染：使用前应确保所有仪器和用具洁净，确保膜上无残留胶。
形状异常常与电泳问题有关，SDS-PAGE电泳的质量至关重要。位置异常可能是蛋白出现聚体或被修饰、出现降解有关。
1. 微笑条带：电泳系统温度偏高，而且电场强度太大（电泳的电场大致呈现U形）时容易出现。应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（考虑加入适合的蛋白酶抑制剂）。
2. 皱眉条带：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。可通过调整装置来避免该问题。
3. 条带拖尾：样品溶解不好，或存在一定程度地蛋白降解。
4. 部分条带变形：可能原因是SDS-PAGE胶中有气泡或者不溶性颗粒。
5. 哑铃状不均匀条带：一是由于配置胶有问题，胶凝固后不均一，可通过重新配置胶，确保胶质量无问题来避免该现象出现；二是样品可能含有过多杂质，在样品使用前离心可有效避免。
6. 条带粘连：可能是上样量太多，或者是制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔。可通过减少上样量和提高配胶质量来避免。
纵向条纹（纹理条带）：样品中含有不溶性颗粒，可能抽提蛋白时出了问题。
三、条带信号弱
WB结果可能出现有目标蛋白条带，但在膜上颜色较浅，可以从抗体、抗原、实验操作和缓冲液等方面进行分析。
1. 抗体相关：可能是抗体浓度过低、抗体和抗原亲和力较低或抗体活性较低等原因，通过提高抗体浓度、选择有效期内的抗体可避免。
2. 抗原相关：可能存在问题是抗原量不足，应检查待测样本，增加上样量。
3. 实验操作相关
转膜不充分：可以使用丽春红S染膜或使用考马斯亮蓝染胶检测转膜效果；检查转膜操作是否正确；可以使用两张膜叠加载一起，防止转膜过度；
抗体染色不充分：增加抗体浓度；延长孵育时间；
洗膜或封闭过度：通过减少洗膜时间、减少封闭剂的量或时间；
曝光时间过短：增加曝光时间即可。
4. 缓冲液相关：可能含有HRP抑制剂，应避免叠氮钠和HRP一起使用。