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目前由于乳腺癌（BC）诊断临床工具的单一化，不同体液的液体活检已成为一种微创诊断策略，它可为早期诊断、积极监测进展和预后复发提供肿瘤标记物的实时数据。细胞外囊泡（EV）是直径为50–1000 nm的纳米级膜结构，由细胞释放到生物液体中。EVs含有蛋白质、核酸和脂质，它们通过细胞间通讯在肿瘤发生和转移中发挥关键作用。使用基于质谱的蛋白质组学和高通量测序技术，研究小EV（sEV）的蛋白质和miRNA是新的BC生物标志物的潜在来源。本文阐述了sEV分离和表征的新技术，总结了用于BC诊断、预后的sEV蛋白和miRNA生物标志物，讨论了当前sEV生物标志物研究的局限性以及未来的应用前景。

重要结果

1. 在BC液体活检中sEV作为生物标志物来源的优势

目前，用于肿瘤诊断和预后最常见方式是组织活检。然而，组织活检很难获得样本，并且来自活检样本的肿瘤分子和遗传信息多为早期检测，筛查和监测存在局限性。为了克服传统生物标志物鉴定和验证手段的技术挑战，提出了基于体液活检的分析，其重点是利用循环肿瘤细胞（CTCs），循环肿瘤DNA（ctDNA），各类体液（包括血液，尿液和唾液）中的细胞外囊泡（EVs）作为肿瘤诊断和预后生物标志物的来源。与组织活检相比，体液活检能够追踪异质性，实时监测肿瘤转移和进展，减少疼痛和副作用，并且获得样本的过程更快，更容易。

 

而在BC体液活检领域中，许多研究人员已将重点转向sEV，因为它们在生物体液中相对更丰富，细胞中的生物含量丰富，且形态稳定。对于临床应用，第一个基于sEV的商业试验ExoDx™ 前列腺（IntelliScore）于2017年推出，由FDA批准，该测试能够将前列腺癌症患者的组织活检采集量减少27%。这表明，来自体液活检的sEV为生物标志物的开发开辟了一条新的途径，可以影响包括BC在内的各种癌症的诊断、预测和治疗。

图1 液体活检在乳腺癌诊断中的应用

2. sEV分离和表征

理想的sEV富集方法简单、高通量、快速、成本低、纯度高。然而，由于生物样本的复杂性和EV的异质性，目前的分离方法都不符合这些标准。克服这些障碍的一种可能是结合两种或多种分离技术。例如，据报道，与单独使用体积排除色谱法(SEC)或超速离心(UC)相比，在BC细胞系中使用聚乙二醇（PEG）沉淀结合SEC，可在更短的时间内富集20至200倍高浓度的sEV蛋白。此外，在BC患者的血清中进行半个周期的UC后结合ExoQuick或Total Exosome Isolation试剂盒，可显著提高产量，减少耗时。总之，继续开发联合分离技术可能是选择和分离sEV的可行选择，这有助于下游分析和临床应用。

 

从乳腺癌症（BC）血样和细胞系中分离出的sEV可以通过大小、形态、浓度和sEV标记物来表征。sEV尺寸和浓度可以通过纳米粒子跟踪分析（NTA）和单粒子干涉反射成像传感器（SP-IRIS）进行分析。电子显微镜（EM）可以根据大小和形态对sEV进行分类。纳米流式细胞术（nFCM）、高灵敏度流式细胞仪（HSFCM）、高分辨率流式细胞（hFCM）和荧光活化囊泡分选（FAVS）可以使用各种sEV标记物对sEV进行亚群分类。sEV蛋白可以通过基于质谱的分析（包括无标记和基于标记的定量）来分析。为了验证sEV蛋白和肽段标记物，可以使用多重反应监测（MRM）、平行反应监测（PRM）、蛋白质印迹（WB）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。

图2 小细胞外囊泡（sEV）检测和表征

3. 在BC诊断、预后和化疗耐药中sEV蛋白生物标志物的作用

从BC患者的细胞上清液和血液样本中收集sEV。分离的sEV通过蛋白质组学方法（如液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）和反相蛋白质微阵列（RPPA））进行分析，并通过sEV蛋白质检测方法（包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质印迹（WB））进行验证。鉴定了BC sEV样品中的各种上调或下调蛋白，可用于BC诊断、预后和预测BC化疗耐药性。

图3 sEV蛋白生物标志物

4. 在BC诊断、预后和化疗耐药中sEV miRNA生物标志物的作用

miRNA是长度约为19-25个核苷酸的短单链非编码RNA分子，可以通过直接与靶mRNA的3'非翻译区结合来抑制基因功能。使用高通量测序（NGS）分析研究发现，miRNA是sEV中最显著的RNA种类，并鉴定出593种独特的miRNA。在血液中，将miRNA封装在sEV中可以提供稳定的环境，促进细胞间的远距离通信。因此，携带释放到血液中的miRNA的肿瘤衍生sEV可能是疾病诊断、预后和治疗管理的宝贵生物标志物资源。

 

收集BC血浆和细胞上清液样本，通过逆转录酶定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、高通量测序（NGS）和微阵列分析分析分离的含有miRNA的sEV。BC样本独特的sEV miRNA表达谱对BC的诊断、预后和预测化疗耐药具有价值。

图4 sEV miRNA生物标志物

结论

为了提高BC的诊断和预后，研究人员越来越关注体液活检，因为其侵袭性有限，适合于肿瘤监测。根据文章描述的证据，监测sEV衍生蛋白和miRNA的变化对于BC生物标志物翻译具有巨大的潜力和前景。