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在蛋白质研究中，精准定量是实验成功的基础。以下常规蛋白定量方法主要有：

方法	原理	优势	局限性	适用场景
BCA法	铜离子螯合显色反应	兼容去污剂、灵敏度高	受还原剂/螯合剂干扰	含SDS/Triton的裂解液样品
Bradford法	考马斯亮蓝G-250与蛋白结合变色	快速(5分钟)、经济、兼容还原剂	受去污剂干扰、线性范围窄	无去污剂的纯蛋白溶液
紫外吸收法	280nm处芳香族氨基酸吸光	无需试剂、无损检测	灵敏度低、受核酸干扰	层析洗脱液快速检测
Lowry法	改良双缩脲-福林酚显色	灵敏度高	步骤繁琐、试剂毒性大	历史方法，现已少用

 

 

一、ELISA检测组织样本为什么要做BCA总蛋白定量？

在组织样本ELISA实验中，BCA总蛋白定量是数据标准化的"黄金标尺"，其意义体现在三个层面：

1. 消除样本间差异

不同组织块大小、细胞密度、裂解效率会导致总蛋白浓度差异巨大。若直接比较ELISA测得的绝对OD值，如同"比较不同体重的运动员举重的绝对重量"——毫无意义。

BCA总蛋白定量前后各组样本间TNF-α差异对比

 

2. 质量控制指标

-裂解效率评估：总蛋白浓度过低提示裂解不充分或样本降解

-异常样本识别：若某样本BCA值偏离均值>30%，需考虑重复实验或排除

 

3. 实验重复性验证

投稿时，审稿人必问："ELISA数据是否经过总蛋白归一化？" 未进行BCA定量直接发表ELISA结果，会被视为**实验设计缺陷**，可能导致拒稿。

 

二、BCA法核心原理

基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将Cu²⁺还原成Cu⁺，BCA鳌合Cu⁺作为显色剂，产生蓝紫色络合物，此络合物可用540-590nm波长检测，并在562 nm处有最大的光吸收值 。反应物的颜色和蛋白质浓度在一定范围内具有线性关系，故可以根据吸光度值的大小来测定蛋白的含量。

 

三、实验操作流程

工作液配制: 试剂A和试剂B按照体积比50:1比例混合 ，配成BCA工作液 。如取50 ml试剂A与1ml试剂B混合，配成51 ml BCA工作液 。两者混合时会有沉淀形成 ，彻底混匀后沉淀消失。

标准溶液配制：标准品临用前取20μL 5mg/mL BSA蛋白标准溶液用PBS溶液稀释100μL ，使其终浓度为1.0mg/mL。浓度梯度设置：0、25、125、250、500、1000、1500、2000μg/mL。

 

a 加入适当体积待测样本，并用PBS补足到20μL

 

b 向酶标板中加入BCA工作液200μL/孔，混匀，37℃放置30min（也可以室温放置2小时，或60 ℃放置30分钟 ）。

 

c 测定562nm处的吸光值，并记录读数；以不含BSA的样品的光吸收值作为空白对照。

注: 冷却至室温后10分钟内完成读数，防止温度漂移影响结果

 

d 以562nm吸光值为纵坐标，BSA含量为横坐标，绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。如果所得到的蛋白浓度不在标准曲线范围内，请稀释样品后重新测定。

注: 由于BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以每次测定都需要做标准曲线。

 

四、注意事项

1.实验所用耗材需去离子水冲洗2次并烘干，残留洗涤剂会抑制显色反应；

2.标曲必须每次实验新配：不同批次试剂、孵育条件差异会导致曲线偏移；

3.脑组织等高脂样本需丙酮脱脂预处理；

4.建议样本采集后-80℃分装保存，避免反复冻融导致蛋白降解。