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酶联免疫吸附实验(ELISA) ：将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶（主要是HRP）标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。

ELISA原理示意图

在生命科学领域多种情况下，及时、高效、经济地测定和量化样品中存在的抗原或抗体是至关重要的环节。

酶联免疫吸附实验(ELISA)已被证明是非常宝贵的研究和诊断工具， 通过将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶（主要是HRP）标记的抗原抗体反应在固相表面，从而测量生物样品中的抗体或抗原。传统ELISA避免了同位素的使用，消除了安全性的隐患，但外部条件对溶液颜色变化的影响巨大且OD值有效的线性范围过低ELISA检测的灵敏度和动态范围大大受制于光吸收技术的缺陷。

高灵敏度荧光ELISA——荧光时代

1982年Halonen等人发表了题为”Time-resolved fluoroimmunoassay: a new test for rubella antibodies”的文章，标志着免疫检测正式跨入荧光时代，这也是DELFIA技术的原型。

简单来说，DELFIA相比传统ELISA实验有两个区别：

1.检测抗体上的酶HRP换成镧系元素螯合物（(Eu, Sm, Tb, Dy）标记。

2.检测方式为荧光检测。

DELFIA技术----Highly sensitive fluorescent ELISA kit”，简单来讲，就是把传统ELISA实验中的检测抗体上的酶HRP换成镧系元素螯合物（(Eu, Sm, Tb, Dy）标记，如下图：

DELFIA（解离增强镧系元素荧光免疫检测）技术：使用镧系元素螯合物（(Eu, Sm, Tb, Dy）标记的试剂，通过洗涤分离去除掉未被结合的试剂，结合时间分辨荧光 (TRF) 检测从而检测体系中被标记的某种目的化合物或生物分子。镧系元素荧光寿命可达微秒甚至毫秒级， 结合时间分辨检测可显著降低自发荧光背景干扰，且其具有很宽的激发光和发射光的波长差异(Strokes’shift)，可极大地提高检测信噪比和灵敏度。

DELFIA技术应用一：检测定量各种复杂样本中的生物标志物(Biomarker)

例一：利用传统ELISA和DELFIA技术比较检测小鼠TNFA

DELFIA技术对样本兼容性和灵敏度对比如下：

DELFIA对传统ELISA技术的灵敏度对比：

DELFIA技术和传统ELISA技术操作流程对比：

TRF技术利用了镧系元素螯合物所发出的荧光衰减时间很长的特点，其灵敏度高，动态范围广。TRF技术的几大特点：

1.镧系元素的宽Stroke’ s shift；

2.镧系螯合物激发后的衰减曲线；

3.普通荧光激发后的衰减曲线；

4.镧系元素的超长衰减时间；

5.很大的Strokes shift，减少了激发光和发射光的干扰，降低了自淬灭，提高了灵敏度；

6.发射光持续时间长，最高可达传统荧光素的数万倍，从而可以延迟检测，扣除背景荧光；

7.高灵敏度，因为扣除了背景荧光，所以可以得到比常规荧光高得多的灵敏度；

8.多重标记，镧系元素中的铕，铽，镝和钐的发射光波长差异明显，最大可以进行四重标记。根据时间分辨荧光的原理衍生出的相关技术，包括DELFIA、LANCE和TruPoint等。

应用案例：cAMP（cyclic adenosine 3’, 5’–monophosphate）检测

HTRF cAMP HiRange 试剂盒可对细胞样品中的 cAMP进行定量。cAMP 是 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 信号传导中的关键第二信使。配体与 GPCR 结合后，会发生构象变化，激活受体，进而激活 G 蛋白。进一步的信号转导取决于激活的 G 蛋白的类型。Gs 蛋白的活化导致腺苷酸环化酶对 cAMP 的上调。细胞产生的游离 cAMP 与 d2 标记的 cAMP 竞争结合抗 cAMP 穴状化合物，因此细胞 cAMP 的增加导致 FRET 的减少，这可以通过 665 nm 发射的荧光减少来检测 (下图)

结论

开发的用于小鼠TNFA的DELFIA时间分辨荧光（TRF）分析，并将其用作评估DELFIA技术与各种生物样品类型兼容性的模型。线性度和加标回收率实验用于确定标准曲线和总体样品相容性的适当稀释剂。DELFIA分析与复杂的样品基质兼容，包括细胞裂解液、细胞上清液、尿液、组织、血清、血浆和全血。还通过评估每种类型样品的灵敏度、动态范围和信噪比来测量分析性能。事实证明，DELFIA是一种高度灵敏的测定方法，具有较宽动态范围，在各种样品类型中均具有极佳的背景信号（参考文献：DELFIA Immunoassay Development Guide，PerkinElmer，2019）